多孔羟基磷灰石与富血小板血浆和纤维蛋白胶复合修复骨缺损刘东光，韦正超，蔡道章，郑军，陈环球，医院外三科，医院骨科，南方医院关医院口腔科
摘要
背景：自体骨移植是治疗骨缺损的最理想方法，但来源有限，供区有一定的并发症，所以寻找自体骨的替代材料一直是骨科学领域的研究方向。目的：观察珊瑚多孔羟基磷灰石、富血小板血浆和纤维蛋白胶复合物修复骨缺损的效果。方法：在新西兰大白兔双侧前臂桡骨中段截骨1.5cm制成骨缺损模型，随机分为3组，实验组植入珊瑚多孔羟基磷灰石、富血小板血浆和纤维蛋白胶复合物，对照组植入自体骨，空白对照组未植入任何物质。
结果与结论：①X射线：实验组术后12周时骨缺损基本修复，塑性完全，愈合过程与对照组同步；空白对照组骨缺损无明显变化。②组织病理学：实验组与对照组术后12周时骨缺损基本修复，出现成熟板层骨及哈佛氏管；空白对照组仅见大量成纤维细胞增生，未见骨质形成。③生物力学：术后2周时实验组最大扭矩和抗扭刚度优于对照组(P0.05)，术后12周时两组最大扭矩和抗扭刚度差异无显著性意义。表明珊瑚多孔羟基磷灰石、富血小板血浆和纤维蛋白胶复合物具有促骨质愈合的作用，甚至在术后早期修复骨缺损的效果优于自体骨。
0引言骨缺损可由于创伤、感染、肿瘤以及发育异常等因素造成。临床已经证明，自体骨移植是治疗骨缺损的最理想方法，但其来源有限，供区有一定的并发症。异体骨具有自体骨一些优越的组织特点，但其存在免疫排斥反应，并有感染HIV和病毒性肝炎等疾病的可能，而且制样、处理和存贮的成本很高，其应用受到很大限制。所以寻找自体骨的替代材料一直是骨科学领域的研究方向，目前国内外研究已取得许多的成果，部分替代材料已经应用于临床。实验设计珊瑚多孔羟基磷灰石、富血小板血浆及纤维蛋白胶复合物修复骨缺损的实验，探讨其作为人工骨替代材料的效果及可行性。
1材料和方法设计：随机分组设计，对照动物实验。时间及地点：于年6月至年3月在医院动物实验室完成。材料：实验动物：6-8月龄健康成年新西兰大白兔55只，由广州市白云区穗北实验动物养殖场提供，许可证号：SCXK(粤)-，雌雄不拘，体质量2.0-2.5kg。多孔羟基磷灰石、富血小板血浆和纤维蛋白胶复合物修复骨缺损实验的试剂与器械：
实验方法：富血小板血浆的制备：用含有3.2%枸橼酸钠的4.5mL一次性真空采血管，从兔大腿外侧静脉抽取4.5mL血液，轻微摇匀，防止凝血，置入离心机中，离心r/min(离心半径10cm)10min。液体分为上清液和红细胞两层。吸取全部上清液及交界面以下1.0-2.0mm的红细胞至另一离心管，再次离心r/min(离心半径10.0cm)10min。弃上清液上3/4，剩余液体约0.6mL，摇匀，即为富血小板血浆。抽取部分0.1mL化验计数，见图1，2
羟基磷灰石-富血小板血浆-纤维蛋白胶复合物的制备：取颗粒型多孔羟基磷灰石0.15g，加入清洁无菌容器中，加入富血小板血浆0.5mL及纤维蛋白主体胶溶液0.2mL，然后加入纤维蛋白原助凝剂0.2mL，搅拌使其充分混合，生成凝胶，即制成羟基磷灰石-富血小板血浆-纤维蛋白胶复合物，见图3。
骨缺损模型的制作：取新西兰大白兔50只，用速眠新Ⅱ(0.2-0.3mL/kg)肌肉注射麻醉，取仰卧位，手术区剃毛备皮，常规消毒铺巾，无菌条件下在双侧前臂桡侧沿桡骨作长约为3.0cm的手术切口，显露桡骨中段(远离骨骺端)，连同骨膜一起切除1.5cm桡骨，造成节段性骨缺损，用干纱布压迫止血后，用骨蜡封闭骨断端髓腔，彻底止血，依次缝合切口。手术前后肌注青霉素20×U，术后每天肌注青霉素40×U(分2次)，连续3d，双侧前臂用自制小夹板固定，常规饲养。术后12周行X射线确定骨不连模型情况，并随机抽取5只兔空气栓塞处死，取双侧标本行组织病理学检查。复合物修复骨缺损：选取已制成骨缺损模型的新西兰大白兔45只，麻醉方法同前，于原切口处剃毛备皮，常规消毒铺巾，显露桡骨骨断端，清除骨蜡及断端间的纤维组织，复通髓腔。随机选择40只，左侧植入羟基磷灰石-富血小板血浆(为兔自体富血小板血浆，制备方法见前描述)-纤维蛋白胶复合物(实验组)；于右侧髋部取髂骨骨块少许(与骨缺损大小相当的骨量)，植入右侧骨缺损处(对照组)；剩余的5只作为空白对照组，骨缺损处不植入任何物质。手术前后肌注青霉素各20×U。全部手术操作均由相同人员完成。术后处理：术后前臂用自制小夹板固定2周，术后每天肌注青霉素40×U(分2次)，连续3d，术后全部兔单笼均衡饲料喂养。一般情况：术后观察所有兔体温、活动、精神、胃纳及伤口愈合情况。同时每组随机抽取5只兔，于术后第3，7天作血常规及生化检查1次。
血小板计数的观察：在富血小板血浆制作过程中，用血红蛋白吸管分别在装有全血及富血小板血浆的离心管中吸取样本0.1mL，从样本中各吸取10μL，血小板稀释液稀释至2mL，混匀，取1滴注入清洁计数池内，放置10min，高倍光学显微镜下人工计数。正常兔全血血小板计数为×L-1，富血小板血浆中血小板计数为×L-1，为全血的4.5倍。放射学检查：于术后2，4，8，12周行兔双侧前臂X射线检查。大体标本观察：于术后2，4，8，12周各随机取10只，空气栓塞方法处死兔，取出双侧标本，观察骨缺损修复情况及骨痂生长情况。空白对照组于术后12周处死所有动物。病理组织学检测：将双侧标本置于体积分数10%中性甲醛中固定，脱钙，石蜡包埋，以缺损区为中心纵行切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察新骨生成情况。生物力学测定：切取双侧完整桡骨，生理盐水纱布包裹储存于-20℃低温冰箱中，标本取齐后一起行生物力学测定。测试时另取正常5只兔双侧桡骨为正常对照，在南方医科大学解放军生物力学实验室(原解放军第一军医大学全军生物力学中心)，于-MiniBionix上行扭转实验。骨水泥固定骨折两端，均匀加载直至桡骨被扭断，观察其断裂部位及断面形状，记录其断裂时最大扭矩和变形角，按White等公式计算其抗扭刚度。主要观察指标：各组X射线、病理组织学及生物力学检测结果。统计学分析：所有数据均以x±s的形式表示，采用配对资料独立样本t检验(α=0.05)，统计软件SPSS13.0。2结果2.1各组动物骨缺损模型观察结果X射线检查：12周后骨缺损区无骨性连接，髓腔闭塞，断端硬化，两侧断端出现少量骨痂。大体标本观察：12周后骨缺损区无骨性连接，可见大量纤维瘢痕组织填充，骨断端硬化，髓腔闭塞，可见未吸收的骨蜡及少量骨痂，骨缺损范围为1.10-1.40cm。组织病理检查：12周后光镜下骨断端髓腔闭塞，可见大量纤维瘢痕组织，有少量软骨细胞及骨细胞，排列无序。2.2术后动物情况所有兔术后体温、胃纳无明显差异，伤口无红肿、化脓，愈合良好。实验组及空白对照组兔血常规及生化检查无明显差异。
2.3各组大体标本观察结果
术后2周时：实验组纤维蛋白部分吸收，植入物与骨断端形成粗大紧密的纤维性连接；对照组自体骨部分吸收，有少量骨痂形成。术后4周时：实验组纤维蛋白完全吸收，有大量骨痂形成，植入物与断端界限不清；对照组自体骨进一步吸收，大量骨痂形成，植入骨与断端界限不清。术后8周时：实验组骨膜部分延续，植入物完全骨化，被大量骨痂包埋；对照组骨膜部分延续，缺损区充满新生骨，覆盖板层骨。术后12周时：实验组骨膜基本完全，植入物完全骨化，羟基磷灰石部分降解，散在分布；对照组骨膜基本完全，缺损区消失，塑性完全，新骨成熟。而空白对照组在术后12周时骨膜少量延续缺损区为纤维瘢痕组织，断端少量骨痂形成，无骨性连接。2.4各组X射线检查结果
术后2周时：实验组少量骨痂影，植入物与断端界限不清；对照组有骨痂影，植入物变小，见图4A；空白对照组骨缺损无明显变化。术后4周时：实验组骨痂影明显增多，断端界限不清，对照组植入物基本消失，大量骨痂影；空白对照组骨缺损无明显变化。术后8周时：实验组骨缺损消失，羟基磷灰石点片状分散骨痂中；对照组断端界限消失，骨皮质形成，髓腔复通；空白对照组骨缺损无明显变化。术后12周时：实验组与对照组均骨皮质连续，髓腔复通，塑性完全，见图4B；空白对照组仅少量骨痂形成，断端硬化，见图5
2.5各组标本组织病理检查结果术后2周时：实验组羟基磷灰石周围大量成纤维细胞及毛细血管增生，可见大量软骨细胞增生，见图6；对照组植入物周围大量软骨细胞、骨母细胞及破骨细胞，见图7。
术后4周时：实验组见软骨细胞钙化，可见编织骨形成；对照组可见编织骨形。术后8周时：实验组可见大量骨细胞，编织骨和板层骨可见，见图8；对照组可见编织骨和板层骨，骨小梁清楚，大量成熟骨细胞。术后12周时：实验组板层骨形成，可见大量成熟骨细胞，见图9；对照组为新骨塑性完全，板层骨形成，大量成熟骨细胞，见图10。空白对照组在12周时仅见大量成纤维细胞，见图11。
2.6各组标本生物力学测定结果见表1，2。
正常兔桡骨最大扭矩为(0.±0.)N·m，抗扭刚度为(1.±0.)Nm/rad。实验组术后2周最大扭矩和抗扭刚度优于对照组(P0.05)，两组术后4，8，12周时两指标比较差异无显著性意义。3讨论实验中羟基磷灰石为无机骨的主要成分，已被广泛用于临床。富血小板血浆是动物自体全血经过二次离心法制备而成，含高浓度的血小板。富血小板血浆中含有高浓度的生长因子，如转化生长因子β、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。而纤维蛋白胶中的促凝剂(氯化钙、凝血酶)与富血小板血浆混合后可以促进血小板凝聚，使血小板α颗粒释放血小板衍生生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等生长因子。有研究发现，在骨髓基质干细胞和骨祖细胞膜上存在血小板衍生生长因子、转化生长因子β1和转化生长因子β2受体。富血小板血浆中的血小板衍生生长因子和转化生长因子β可能通过与靶细胞(骨髓基质干细胞和骨祖细胞)膜上的受体结合发挥作用，促进骨髓基质干细胞和骨祖细胞向成骨细胞分化，从而增强新骨再生，加速骨缺损修复。富血小板血浆中血小板衍生生长因子在骨创伤修复早期起重要作用，血小板衍生生长因子在其他因子的协同下能促进结缔组织的迁移和增殖，刺激微血管内皮细胞增殖和毛细血管生长，刺激骨DNA和蛋白质合成，促进脱钙骨诱导成骨和成软骨。富血小板血浆中的血管内皮生长因子有促进新生血管形成的作用，大量新生血管的形成为种子细胞提供丰富营养，也可促进骨缺损修复。因此，富血小板血浆符合Chalmers的3要素：诱导刺激物；被诱导的靶细胞－间充质细胞；有利于新骨形成的丰富血供环境。同时以羟基磷灰石+纤维蛋白胶为载体，提供了骨缺损的机械支撑填充材料，同时可以对富血小板血浆中生长因子起缓释作用，保持局部有高浓度生长因子的持续释放，同时可以止血，促进伤口愈合等。Johnson等[3]指出实验性骨缺损需要在一些不利于骨生长的环境中进行，如骨缺损超过骨干直径的三四倍(即不能自行修复的长度)，骨局部肌肉覆盖较少，红骨髓含量少的成年动物等，依靠自身力量不能修复骨缺损。实验中选用6-8月龄成年新西兰大白兔，测量兔桡骨中段直径为(3.32±0.30)mm(n=10)，造成15mm骨缺损，达其骨干直径的四五倍。中段骨缺损远离红骨髓较丰富的干骺端，加上桡骨中段位置表浅，表面为较薄的伸趾肌腹与肌腱移行处，只有少量肌肉覆盖，这些均不利于骨缺损的修复；另外在截骨时连同骨膜一并去除，用骨蜡将骨髓端髓腔封闭，消除了骨外膜成骨及骨髓腔成骨的因素。在造模12周后，从X射线看骨缺损区域无骨性连接，断端硬化，髓腔闭塞，两侧断端只有少量骨痂形成，符合骨缺损的X射线表现；大体标本显示骨缺损区域为大量纤维瘢痕组织填充，无骨性连接，骨断端硬化，髓腔闭塞，两侧断端可见少量骨痂形成，骨缺损范围为1.10-1.40cm；组织病理学见骨断端生长不良，髓腔闭塞，有少量软骨细胞及骨细胞增生，纤维膜覆盖，缺损区为纤维瘢痕组织，符合骨缺损病理特征。从以上特点来看，实验骨缺损是可靠的。羟基磷灰石是骨的主要无机成分，其主要成分是钙、磷，其化学成分、晶体结构、物理化学性能与人体正常骨的无机成分相似，羟基磷灰石植入人体后能通过正常新陈代谢途径置换Ca、P，并且羟基通过氢键与人体组织键合达到完美亲和，生物相容性极好，无免疫排斥现象；纤维蛋白胶含有纤维蛋白原、凝血酶、凝血因子等是血凝块的主要成分，无抗原性，无细胞毒性，在国内外临床上已经广泛应用[4-8]；富血小板血浆是自体全血经过二次离心制得，为自体组织，无毒性、无免疫原性，无传染疾病等危险，因此该复合物具有良好的组织相容性。在实验中从术后兔一般情况、血常规及生化结果看，该复合物生物相容性好；第2，4周组织病理学检测未见吞噬细胞、淋巴细胞及多核巨细胞大量增生，说明局部未发生免疫排斥反应，组织相容性好。骨组织缺损的修复过程本质上是细胞的生物学过程和应力作用下的生长过程，故了解骨的生物力学特征对于临床具有重要意义。骨生物力学测定已经成为实验性骨折愈合程度的评定方法。骨的机械性能测试主要是通过采用拉伸、压缩、剪切、弯曲和扭转的方法，测定其强度和刚度，骨组织对不同力学载荷耐受程度大小顺序为压缩载荷弯曲载荷扭转载荷，可见骨组织对扭转力学试验是比较敏感的折愈合刚度。
在生物力学实验中，动物标本取出后立即进行实验最好，但很难做到。但可以在低温或深低温下保存，而其生物力学性质基本没有改变。Langer等[11]将标本用生理盐水纱布包裹后放入塑料袋内，存入-20℃的冰箱内，20d后自然解冻进行实验，其力学性质没有明显改变。Pelker等[12]将大鼠骨骼分别在-20，-70，-℃等3种不同温度下冷冻后，测量长骨的抗扭强度没有发生变化。杨克强等分别测试深低温保存1年和7年腓骨标本的极限弯曲强度、极限压缩强度和弹性模量，未见明显差异，可见深低温冷冻方法储存骨，储存时间长短对骨的生物力学特性无明显影响。实验中标本取出后，生理盐水纱布包裹，保存在-20℃低温冰箱内，测试前放入生理盐水或Ringer氏液内，恒温水浴37℃复温后，于生物力学测试仪上性力学测试。结果表明在骨缺损修复中不论是复合物还是自体骨，其力学性能的恢复是一个渐进性过程，开始最大扭矩和抗扭刚度都较低，随愈合时间的延长其最大扭矩和抗扭刚度都显著增强，最后达到正常。12周时与正常桡骨无明显差异。
愈合刚度代表骨抵抗变形的能力，而愈合强度代表其抗扭最大外力的能力。实验中还发现其愈合刚度的恢复要快于愈合强度，术后4周复合物侧和自体骨侧抗扭刚度已达到正常桡骨的67.46%和65.84%，而最大扭矩仅为正常骨的43.50%和40.85%。术后8周复合物的抗扭刚度与正常桡骨差异无显著性意义(P0.05)，而其最大扭矩与正常桡骨差异仍有显著性意义(P0.05)。这与骨折愈合过程中的生物力学特征相似[14]。实验结果提示在移植中期4-8周即可进行适当的功能锻炼。
术后4，8，12周时复合物与自体骨最大扭矩及抗扭刚度比较差异无显著性意义(P0.05)，而在2周时，复合物最大扭矩及抗扭刚度均明显高于自体骨侧，其原因可能是在骨折愈合早期，富血小板血浆中生长因子浓度较高，以羟基磷灰石及纤维蛋白胶为载体，生长因子可以缓慢释放发挥作用，促进血管大量再生，为缺损局部提供丰富的血供，刺激局部成骨细胞的成骨作用，促进骨痂形成，与羟基磷灰石紧密结合，使其在生物力学上优于自体骨。一般认为自体骨移植的效果较其他移植物效果好，是修复骨缺损最为理想的方法，也是评价其他修复方法的基本标准，号称骨修复的金标准。实验结果表明复合物与自体骨愈合过程相当，早期还优于自体骨移植，是一种较为理想的移植材料，为临床应用提供了实验研究基础。
理想的骨移植材料具有以下3个基本特点中的一个或多个：能诱导未分化的原始细胞分化为骨细胞(骨诱导性)；具有胶原基质，可以提供支架用于物理支撑并指导修复过程(骨传导)；能直接形成骨的间质干细胞。羟基磷灰石作为人工骨替代材料，具有骨传导性，实验中应用多孔羟基磷灰石，平均孔径为-μm，孔隙率为66%，其多孔性结构有其独特的优点：较致密材料易塑型，质量轻；为新骨组织长入其中提供通道和容纳空间；多孔结构形成了材料实体中的三维空间，增大了材料与植入区组织器官的界面，有利于界面结合的反应过程，并为携带骨诱导物质(骨髓、细胞、生长因子等)提供空间；内联孔有利于材料深部的血管彼此相通，以保证长入材料深部组织的营养供应；除材料与宿主骨的结合外，多孔结构利于机体骨组织的长入形成机械性内锁，增强植入材料与机体的结合，为固位创造了条件。但其缺点为缺乏骨诱导性。纤维蛋白胶是一种天然的细胞外基质，由动物组织中提取的多种可凝性蛋白组成，可避免某些人类血液传染性疾病的传播；其生物相容性、可塑性、可降解性良好；促进细胞生长、组织相容性好、无致敏作用；无细胞毒性，制备方便，是近年来组织工程支架的主要研究方向之一。纤维蛋白胶是凝血反应的最后阶段形成的，其主要由主体和催化剂两部分组成，主体中含有纤维蛋白原和第Ⅻ凝血因子，催化剂主要含凝血酶和钙离子，当纤维蛋白原与凝血酶接触后，纤维蛋白原肽链A、B被凝血酶水解后，形成纤维蛋白单体，该单体疏松聚合形成网状结构的可溶性纤维蛋白多聚体。第Ⅻ凝血因子被凝血酶激活后，与钙离子促使可溶性纤维蛋白多聚体转化为不可溶性的纤维蛋白多聚体，最后
造成骨延迟愈合和骨不连的原因很多，局部血供不足，生长因子缺损或活性不足为主要因素。实验中使用富血小板血浆，其内含有多种高浓度生长因子，可以明显诱导及促进成骨。实验结果表明，该复合物具有明显的成骨作用。
参考文献（略）
热点文章
